导读

脑脊液标本中的载脂蛋白2是高度敏感的生物标记物，可准确预测成年患者的细菌性脑膜炎，牛津大学临床研究院的T.T.hanh等学者在越南胡志明市开展探索性队列及临床验证性队列研究，等其结果发表年7月的《ClinMicrobiolInfect》上。

PMID:

DOI:10./j.cmi..07.

研究背景

Background

中枢神经系统感染（CNS）是全球范围内发病率和致死率均较高，常见的CNS包括非结核细菌性脑膜炎（BM）、病毒性脑炎、结核性脑膜炎（TBM）和隐球菌性脑膜炎，还包括其他超过种已知感染类型。过去10年中，也发现了一些抗体介导的脑膜炎，如抗NMDAR脑炎等，挑战了我们目前常规的诊断方法。

临床表现通常无法有效对病因进行鉴别诊断，标准的实验室检查能鉴别的病因60%。但是临床上CNS的诊治常因病原体而异。如何快速准确诊断感染病原体对启动合适的治疗、改善患者预后至关重要。在过去10年中，质谱（MS）作为一种基于细菌全细胞蛋白质组指纹图谱分析的技术，敏感性高，可用于鉴别感染和非感染性疾病的新型诊断性生物标记物。本研究采用串联质谱、液相色谱串联质谱法（LCMS/MS），在45例颅内感染的患者脑脊液中检索新型诊断性生物标记物，然后在另外例CNS感染患者的治疗中得到验证。

研究方法

Methods

CSF标本来自三个不同的临床研究（图1），这些研究均是为了提高成人急性CNS感染的诊断。同时收集了脑脊液和血浆标本，采集了患者人口学资料、临床数据和常规诊断性检查。所有标本在分析前都储存在-80℃。

常规检查：疑诊患者的CSF标本送培养和/或显微镜细菌涂片镜检（包括分枝杆菌）、真菌的标准检查。如临床怀疑但其他病原学检查阴性时，对疑诊单纯疱疹病毒（HSV）者的标本采用PCR法进行检测，水痘带状疱疹（VZV）也采用PCR法，登革热病毒（DENV）、日本脑炎病毒（JEV）或腮腺炎病毒（MuV）通过检测血清IgM。麻疹的诊断则同时结合临床特征和麻疹IgM。

图1.潜在生物标记物的发现和临床样本来源

各类中枢神经系统感染的诊断都是基于标准实验室诊断，如CSF病原学检查阳性（如常规培养、革兰涂片、细菌性脑膜炎时采用PCR）则为确诊感染；如诊断性治疗有效和/或临床医生判断则为疑诊CNS感染（TBM、BM、脑炎）。本研究中将疑诊和拟诊的TBM（Marais诊断标准）定义为临床可疑TBM。临床上如患者没有脑膜炎体征、CSF实验室检查正常、微生物培养及血清学检查阴性，则排除CNS感染。

研究结果

Results

纳入45例患者，其中40例为实验室确诊CNS感染（TBM、BM和脑炎），5例为非CNS感染（图1）。

本研究招募了例疑诊CNS感染的成年患者进入验证研究（图1），排除43例非CNS感染患者后，64%（/）患者明确诊断。TBM最常见，其次是病毒性脑炎和BM，其余还包括抗NMDAR脑炎、隐球菌性脑膜炎、寄生虫嗜酸性粒细胞性脑膜炎、神经弓形体病（图1）。TBM、BM及病毒性脑炎的诊断阳性率分别为80%（97/）、69%（44/64）和32%（29/92）。BM和脑炎的具体病原学诊断见图1.

对45份CSF进行了LC-MS/MS分析，共发现个蛋白，亚组分析共确定种可量化的对临床有意义的蛋白，尤其是BM患者（图2（A））；在60例BM和TBM患者CSF中有19例显著表达。病毒性脑炎患者中没有诊断性生物标记物。在BM组患者中，载脂蛋白2（LCN2，也称为中性粒细胞明胶酶相关脂蛋白即NGAL）对BM诊断预测价值为敏感性%（95%CI为0.73-1），特异性为89%（95%CI为0.74-0.95），AUROC为0.97，95%CI为0.9-1。

图2.LC-MS/MS和LCN2ELISA分析

ELISA分析LCN2来确认原始LC-MS/MS结果

为了验证LC-MS/MS结果，对45份CSF标本进行了定量ELISA分析，结果提示LCN2浓度59ng/ml可从TBM、病毒性脑炎及非颅内感染患者中准确鉴别出BM，AUROC值0.97（95%CI为0.92-1），敏感性为%（0.72-1），特异性为0.86（95%CI为0.71-0.94），见图2（B）（C）。定量ELISA分析评估LCN2的诊断价值证实了LC-MS/MS的结果。

CSFLCN2在验证试验中浓度

LCN2浓度在不同的CNS感染中存在明显差异，其中BM组最高（中位浓度.8ng/ml，2.5-.3ng/ml），其次是TBM组（中位浓度为86.3ng/mL，1.1-.4ng/mL），见图3（A）。相比之下，抗NMDAR脑炎（中位浓度为0.9ng/mL，0.2-27.8ng/mL）、无中枢神经系统感染（中位浓度为0.2ng/mL，0.2-.3ng/mL）患者中未检测到LCN2或其浓度非常低。BM组患者中，不同病原体感染患者的CSF中LCN2无明显差异，但病原学确诊组相比没有病原学不详组浓度要更高，两组在入院时患病时间类似。CSF中LCN2的浓度在BM组患者中会随疾病进程下降，而在TBM组会随病程升高。LCN2浓度和TBM住院期间预后不良相关，在其他组中没有相关性。

图3.LCN2的ELISA分析结果和验证队列中AUROC分析

验证队列中获得的LCN2浓度分析表明，LCN2可准确鉴别BM和其他CNS感染，AUROC从0.9（BMvsTBM，LCN2阈值为ng/mL）到0.99（BMvs其他CNS感染即非脑炎非TBM，LCN2阈值为ng/mL），诊断OR值≥44.8。在鉴别BM和其他中枢神经系统感染（包括TBM和脑炎），LCN2优于现有指标（脑脊液白细胞、蛋白、乳酸及葡萄糖），见图4（A）和（B）。但LCN2结合脑脊液白细胞、蛋白、乳酸和葡萄糖浓度指标，鉴别BM的能力最强，预测价值AUROC从0.94（95%CI0.8-0.98）升高到0.96（95%CI0.93-0.99），诊断OR值从66.2升高.3，见图4(C）。亚组分析显示将LCN2加入诊断模型（该模型中纳入脑脊液白细胞、蛋白、乳酸和葡萄糖）在鉴别TBM和BM时，AUROC从0.89升高到0.93，但在鉴别BM和其他感染（如脑炎、其他CNS感染）时则只有轻度改善，见图4（D）。LCN2不能鉴别确诊和疑诊BM患者。

图4.LCN2预测细菌性脑膜炎的价值（和常规CSF检查相比，及联合常规CSF检查时的诊断价值）

CSF和血浆中LCN2的关联

本研究在22例BM患者患者（14例实验室确诊，8例临床怀疑）中评估了血浆LCN2是否能替代CSFLCN2监测。结果显示血浆LCN2明显低于CSF中的浓度，分别为.0（33.7-.8）ng/ml和.1（15.7-.3）ng/mL，p0.。CSF和血浆LCN2没有相关性（Spearman相关系数R0.37，p=0.08），表明LCN2是CNS时细菌入侵后脑室内产生。

讨论

Discussion

通过MS技术，本研究首次发现LCN2是潜在的BM的诊断标记物，验证性队列研究也显示LCN2能准确将BM从其他CNS感染中鉴别出来。LCN2优于现有的脑脊液生化常规检查（如CSF白细胞、蛋白、葡萄糖、乳酸），如将两者结合，对BM的诊断价值更高。且本研究显示无论是否联合其他实验室诊断指标，LCN2都能有效鉴别BM。

LCN2由中性粒细胞、肝细胞及肾小管细胞分泌，有抗菌特性，可通过干扰细胞的铁摄取来抑制细菌生长。最近有研究表明LCN2是诊断肺炎链球菌所致的严重血流感染、肺炎的敏感的生物标记物。有研究在BM患者中有报道其CSF中LCN2浓度升高，但既往的研究